细胞名称：DYR0100

细胞描述

将人包皮细胞诱导成 iPS 细胞，通过重编程转录因子为：OCT4、SOX2、KLF4、

                 MYC 诱导建立 iPS 细胞，培养时无需饲养层细胞。

1、形 态：球形克隆

2、来源性别：男性疾 病：健康

3、年 龄：新生儿

4、细胞来源：从 ATCC 引进（http://www.atcc.org/）

                      ATCC number: ACS-1011TM

5、冻存日期/代数：详见 冻存管/培养瓶 标识建议复苏培养体系：1 个 T25 培养瓶

6、细胞状态：良好

7、支原体检测结果：阴性

8、细胞用途：仅供科研使用。

一．培养基及培养冻存条件准备

1、推荐使用 iPS细胞完全培养基试剂盒培养人胚胎干细胞

2、所需的其它试剂和材料：Y27632（1mg）；Matrigel（5mL）；iPS细胞消化液（500mL）；ES细胞专用冻存液（100mL）；另需细胞培养皿/瓶/板，15mL离心管和移液管等细胞培养耗材

3、.培养流程：

（1）完全培养基制备

①在室温（15-25℃）或冰箱内（2-8℃）过夜解冻细胞培养基添加剂，可在无菌条件下将添加剂分装为适量的工作等份，并在-20℃下冻存。冷冻的分量须在3个月内用完。解冻后的分量应该一天内制备成完全培养基。请勿在解冻后再次冷冻。

②在无菌条件下将20mL的添加剂全部解冻后加入到500mL的基础培养基中，充分混匀。完全培养基在（2-8℃）下储存时刻维持稳定状态最多2-3周，或在-20℃下冷冻时刻维持稳定状态最多3个月。在室温（15-25℃）或冰箱内（2-8℃）过夜解冻冷冻的培养基，不要长时间放在37℃水浴内加热培养基。

如果在无菌条件下制备，细胞完全培养基可直接使用。

（2）Matrigel工作液的配制与包被

        鉴于基质胶的操作环境要求比较严格，为保证您的实验顺利，特此对以下几个方面进行温馨提示：

① 收货时，首先确认还有干冰，Matrigel成固态，液面水平，如有异常请及时拍照取证并联系我们。

②. 整个Matrigel只能分装一次，在分装前，要先放4℃冰箱（最好先把Matrigel插在冰上，然后放入4℃冰箱）过夜，且分装用的枪头、EP管等都要提前-20℃预冷（基质胶在10℃以上会发成胶凝固导致基质胶报废），整个分装过程都需在冰上进行，且以后每次试验时拿出本次用量所需的基质胶。

③. 实验人员手心不要接触基质胶，如：要手持装有Matrigel的EP管的上方，防止体温使基质胶成胶凝固。

④ Matrigel的稀释比例建议为100倍稀释。

本库建议的配制Matrigel工作液方法：

1.、稀释前将Matrigel放入4℃冰箱过夜融化。

2、将适量体积的稀释液（DMEM/F12或PBS）置4℃冰箱预冷。

3、将融化的Matrigel与稀释液从冰箱中取出并打开盖子，用移液管吹吸稀释液几次以冷却移液管，并吸取少量稀释液加入Matrigel管中混匀，将Matrigel转移到稀释液中，并吹打混匀。（因为Matrigel遇15℃以上温度就会成凝胶粘在原装玻璃壁和移液管壁上，故Matrigel从冰箱拿出来以后尽快打开盖子并转移到预冷的稀释液中，吸取Matrigel的移液管一定要冷却）。

4、立即用稀释后的Matrigel包被培养板或培养皿。对于6孔板，每个孔使用1mL稀释后的Matrigel，对于6cm的培养皿，每个孔使用2mL稀释后的Matrigel，晃动培养板使Matrigel溶液均匀的分布在表面上。

5、使用前，包被的培养板应放在培养箱（37℃）下至少1h。请勿让培养板脱水。在培养板可供使用之前，请勿移除Matrigel溶液。

如果不立即使用，培养板必须密封，以防止脱水。包被后的培养板可在2-8℃下最多储存7天。

如果Matrigel溶液并未完全覆盖表面，则无法实验最佳的细胞培养，因此，不建议使用含有溶液已蒸发区域的培养板。

如果已将培养板在2-8℃下储存，则在移除Matrigel溶液之前，将培养板在培养箱（37℃）下放置30min。

Y27632的配制

1、Y27632粉末溶解在PBS中，配制成浓度未10mM的储存液，0.22μm滤膜过滤除菌。分装后冷冻于-20℃。

2、Y27632提高复苏和传代后的克隆形成率，所以只在复苏和传代步骤添加（1:1000，即终浓度为10μM），换液时不添加。

复苏

1、在开始复苏前，将所有试管、预热后的培养基和培养皿准备好，已确保尽快完成复苏过程。

2、将冻存管从液氮中取出，快速在37℃水浴槽中解冻，轻柔持续地摇动冻存管，直到只剩下一个小冷冻团。从水浴槽取出冻存管，70%乙醇擦拭进行消毒。

3、使用移液管将冻存管中含有iPS细胞的冻存液轻轻转移至一个含有5-6mL已经预热的完全培养基的15mL离心管中，过程必须轻柔防止吹散细胞团。

4、室温300g离心5min。

5、吸出培养基，确保细胞团完整。

6、然后缓慢加入1mL完全培养基，用手指轻弹离心管底部，使细胞团脱离底部并分散。

7、轻轻的将此1mL细胞悬液转移至已包被的培养皿/板/瓶，根据最终培养细胞的液体体积，加入ROCK inhibitor Y27632，终浓度为10μM。

8、将培养皿/板/瓶置于37℃培养箱中，每天更换培养基（换液不需要再添加Y27632，但培养基需提前预热）。

传代

1、当集落变得较大、中心变得密集、明亮（对比边缘），相邻的集落开始融合时，此时可进行传代。

2、传代前，准备 37 ℃预热好的无钙镁PBS 溶液及消化液，完全培养基。

3、吸走上清，并加入37℃预热好的PBS 溶液清洗1次。

4、加入适量（按 6 孔板每孔加 1mL，6cm 皿加 2mL，10cm 皿加 3mL 的量）的 37℃预热好的消化液。

5、37℃放置1-2min，用手指轻弹皿/板/瓶身，显微镜下观察到大部分克隆边缘开始脱离培养皿/板底，克隆内部大部分细胞成团脱落。

6、加入适量的完全培养基终止消化。

7、移入离心管，300g离心5min。

8、离心后重悬（重悬步骤参照复苏4-5步）。

9、传代比例为 1：6—1：8，根据最终培养细胞的液体体积，加入ROCK inhibitor Y27632，终浓度为10μM。

10、将培养皿/板/瓶置于37℃培养箱中，每天更换培养基（换液不需要再添加Y27632，但培养基需提前预热）。

冻存

1、当集落变得较大、中心变得密集、明亮（对比边缘），相邻的集落开始融合时，此时可进行传代。

2、传代前，准备37 ℃预热好的无钙镁 PBS 溶液及消化液，完全培养基。

3、吸走上清，并加入37℃预热好的 PBS 溶液清洗1次。

4、加入适量（按 6 孔板每孔加 1mL，6cm 皿加 2mL，10cm 皿加 3mL 的量）的 37℃预热好的消化液。

5、37℃放置1-2min，用手指轻弹皿/板/瓶身，显微镜下观察到大部分克隆边缘开始脱离培养皿/板底，克隆内部大部分细胞成团脱落。

6、加入适量的完全培养基终止消化。

7、移入离心管，300g离心5min。

8、离心后重悬（重悬步骤参照复苏4-5步）。

9、使用预冷的冻存液轻轻的重悬细胞团，然后将细胞悬液转移至冻存管，冻存按 6 孔板每孔冻 1 支，6cm 皿冻 2-4 支，10cm 皿冻 6-12 支。

注意事项

1、每次换液时要观察细胞生长状况以及细胞形态的变化并对细胞进行拍照，但是在培养箱外操作的时间不要过长，避免因温度对细胞生长状态造成不利影响。

2、更换培养基之前，要对新的培养基进行37℃预热。为了避免反复加热培养基而造成的培养基中各种成分的影响，只对本次要更换的量进行预热处理。

3、用移液器吹打细胞，因为移液管的端部较为圆滑，对细胞伤害的程度小于用1ml的枪。

4、细胞密度达到80-90%时要及时传代，否则会造成细胞形态的变化。但是，如果细胞在铺板时混合不均匀，而形成部分集落过大的情况，即使没有达到80-90%也要进行传代。