细胞特性

1、 来源：人

2、 形态：上皮细胞样，贴壁生长

3、 含量：>1x10^6细胞数

4、 规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

5、 用途：仅供科研使用。

运输和保存

干冰运输及复苏好存活细胞

（1）1mL冻存管包装干冰运输，收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。

（2）T25瓶复苏的存活细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。

细胞接收后的处理

1、收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

2、请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。

3、贴壁细胞：细胞在37℃培养箱中放置2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中）,加入新配制的完全培养基6-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。

4、备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。   收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1：2传代 。

一．培养基及培养冻存条件准备

1、准备MEGM kit培养基 （Lonza/Clonetics,CC-3150）备注：培养基包含（A+B）

A :   MEBM基础培养液 （货号CC-3151）         

B:   细胞生长添加剂 5管 （货号CC-4136）   5管

1.   CC-4009G      BPE                                 2.0ml

2.   CC-4017G      hEGF                               0.5ml

3.   CC-4021G      INSULIN                          0.5ml

4.   CC-4031G    HYDROCORTISONE          0.5ml

5.   CC-4081G      GA-1000                          0.5ml

C: 霍乱毒素（cholera toxin）   (100ng/ml)   500ul

D:   P/S青霉素-链霉素                                    5ml

2、培养条件：

气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。 培养参考: 细胞消化时间25-30min (0.25%胰酶) 。传代比例1:2，传代周期3-4天.

注意事项:

（1）该细胞较难消化，注意延长消化时间，消化到细胞收缩变圆，轻拍培养瓶侧边，细胞可以滑落方可终止消化

（2）该细胞贴壁较慢，传代后贴壁24~48小时后再进行后续操作。

（3） 建议使用Corning的cellbind细胞培养瓶(货号: 3289) 进行细胞培养

（4）使用0.25%胰酶消化后，加入几倍体积的完全培养液稀释后（或者加入加入3-4ml用RPMI1640或者DMEM等基础培养基配置的含10%FBS）的培养基来终止消化后，1000rpm/5min,去除胰酶后加入完全培养液进行传代。

3）冻存液：92%完全培养基，8%DMSO，现用现配。

二． 细胞处理

1、 冻存细胞的复苏

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2、 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法

①. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

②. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶于培养瓶中（T25瓶1-2mL， T75   瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化25-30min (0.25%胰酶) ，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入加1ml0.1%大豆胰蛋白酶抑制剂终止消化。或者加入3-4ml含10%FBS（可用1640或者DMEM代替）的培养基来终止消化。

③.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3、细胞冻存:

收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

下面T25瓶为例；

①. 细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×10^6~1×10^7个活细胞/ml.

②. 1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每1ml冻存液含1×10^6~1×10^7个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

③. 将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。