细胞介绍

VK2/E6E7 是一种上皮细胞系，于 1996 年从一位因子宫内膜异位症而接受子宫切除术的 32 岁女性患者的粘膜中分离出来。

细胞特性

1，来源： 32 岁女性患者的阴道粘膜

2，形态：上皮细胞样，贴壁生长

3，含量：>1x10^6   细胞数

4，规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

5，用途：仅供科研使用。

运输和保存

干冰运输及复苏好存活细胞

1，1mL冻存管包装干冰运输，收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。

2，T25瓶复苏的存活细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。

细胞接收后的处理

1，收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

2，请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。

3，贴壁细胞：细胞在37℃培养箱中放置2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中）,加入新配制的完全培养基6-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。

4，备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。   收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1：2传代 。

一．培养基及培养冻存条件准备

1，准备 角质细胞无血清培养基，添加对应因子按照收到的生长因子对应规格：1mL加0.2%, 5mL 加1%，同时添加1% P/S 来培养细胞。或者 准备Defined K-SFM (part of kit NO:,10744-019) 来培养细胞。

备注:

①. Defined K-SFM (part of kit NO:,10744-019)培养液包含两个组份：基础培养基1瓶500mL（货号10785-012）+生长因子1管1mL   ( 货号10784-015).

②. 该细胞生长依赖于人表皮生长因子EGF，故而生长不能过密，请在融合度达到80%时进行传代。

③.使用0.05%胰酶消化细胞，由于角质细胞无血清培养基或者Defined K-SFM为无血清培养液无法终止胰酶消化，所以消化完成后要通过离心（建议125xg离心5到10分钟）（或者加入加入3-4ml用RPMI1640或者DMEM等基础培养基配置的含10%FBS）的培养基来终止消化，1000rpm/5min,去除胰酶后再加入细胞完全培养液进行传代培养。

④.Defined K-SFM是一种无血清培养基，添加生长因子后请不要过滤。在无血清培养体系中，细胞生长缓慢并且需要一些时间才能贴壁，可以根据实验要求酌情添加1%FBS来进行培养。

2，培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3，冻存液：完全培养液92.5%，7.5%DMSO，现用现配。

4，传代比例：如果没有特别说明，收到细胞后的第一次传代一般是1:2。传代周期：4-6天，换液频率：每周 2-3次。

二．细胞处理

1，冻存细胞的复苏

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2，细胞传代：

如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法

①. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

②. 加入0.05%胰蛋白酶于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟左右，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

③.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3，细胞冻存:

收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

下面T25瓶为例；

①. 细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×10^6~1×10^7个活细胞/ml.

②. 1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

③. 将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。